蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者。測(cè)量組成蛋白質(zhì)的氨基酸的排列順序被稱(chēng)為蛋白質(zhì)測(cè)序。由于缺乏普適、高效的測(cè)序技術(shù)，人類(lèi)對(duì)蛋白質(zhì)的了解還極其有限，生命世界的諸多奧秘仍待破解。
近日，浙江大學(xué)化學(xué)系馮建東團(tuán)隊(duì)提出了基于固體納米孔的氨基酸識(shí)別方法。他們構(gòu)建了直徑為1納米左右的人工納米孔，可進(jìn)行單個(gè)氨基酸分子的精準(zhǔn)識(shí)別，分辨率達(dá)到0.94道爾頓。這顯示出人工納米孔應(yīng)用于單分子蛋白質(zhì)測(cè)序的可能性。相關(guān)研究論文發(fā)表于《自然·通訊》。
一項(xiàng)持續(xù)了60多年的挑戰(zhàn)
(相關(guān)資料圖)
1951年，英國(guó)科學(xué)家弗雷德里克·桑格完成了對(duì)胰島素的測(cè)序工作，并因此獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。這是人類(lèi)第一次測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸組成，從此人們認(rèn)識(shí)到蛋白質(zhì)具有特定的氨基酸序列。
但此后，桑格在蛋白質(zhì)測(cè)序方面陷入了持續(xù)10年的瓶頸期。他轉(zhuǎn)而嘗試進(jìn)行DNA測(cè)序和RNA測(cè)序，發(fā)明了后來(lái)被稱(chēng)為“桑格測(cè)序法”的雙脫氧測(cè)序法。該方法被廣泛應(yīng)用于測(cè)定基因和基因組序列，這項(xiàng)發(fā)明改寫(xiě)了整個(gè)生命科學(xué)的研究進(jìn)程和途徑，引領(lǐng)了人類(lèi)三大科學(xué)計(jì)劃之一的基因組計(jì)劃和基因測(cè)序領(lǐng)域的飛速發(fā)展。
基因測(cè)序方法發(fā)展迅猛，而與之相較，蛋白質(zhì)測(cè)序發(fā)展無(wú)疑是滯后的?！暗鞍踪|(zhì)測(cè)序‘起跑’比基因測(cè)序早，但沒(méi)有像基因測(cè)序技術(shù)那樣被廣泛應(yīng)用。”浙江大學(xué)生命科學(xué)研究院研究員蔣超說(shuō)，比起基因，人們對(duì)蛋白質(zhì)的了解要少得多?；诖?，一種普適高效的蛋白質(zhì)測(cè)序手段的誕生有著重大意義。
相比于基因測(cè)序，蛋白質(zhì)測(cè)序遇到的主要困境在于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜且構(gòu)成的單元氨基酸具有更強(qiáng)的異質(zhì)性，這意味著蛋白質(zhì)測(cè)序手段所需的檢測(cè)靈敏度要高得多。蛋白質(zhì)也沒(méi)有類(lèi)似核酸擴(kuò)增的技術(shù)，導(dǎo)致目前人們難以分析低豐度蛋白質(zhì)，因此在單分子層面上對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)序的需求日益迫切。
蔣超介紹，目前測(cè)量蛋白質(zhì)的氨基酸序列的主流方法是利用質(zhì)譜儀，但此方法在檢測(cè)速度、讀取長(zhǎng)度和靈敏度方面還存在很多不足之處，其效力遠(yuǎn)不及基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)。
“納米孔主要可分為兩大類(lèi)，一類(lèi)是生物納米孔，一類(lèi)是固體納米孔，目前應(yīng)用較多的生物納米孔本身由肽鏈折疊而成，所以其靈敏度受限于納米孔本身的尺寸。”馮建東認(rèn)為，要解決蛋白質(zhì)測(cè)序的研究需求，必須從根本上突破傳統(tǒng)納米孔靈敏區(qū)域的長(zhǎng)度限制。
納米孔“盲盒”挑戰(zhàn)測(cè)量極限
想搞懂納米孔測(cè)序，不妨將其理解為一個(gè)拆盲盒的過(guò)程。假設(shè)盲盒里有一條項(xiàng)鏈，玩家僅知道這條項(xiàng)鏈由幾顆珠子構(gòu)成，不同顏色珠子的排列方式要靠猜測(cè)。
馮建東說(shuō)，盲盒里如果是某個(gè)基因“項(xiàng)鏈”，對(duì)應(yīng)基因有4種不同的堿基，猜的就是4種顏色珠子的排列順序。而對(duì)于蛋白質(zhì)“項(xiàng)鏈”來(lái)說(shuō)，組成蛋白質(zhì)的有20種天然氨基酸，其排列組合數(shù)量就將飆升到天文數(shù)字。
“結(jié)構(gòu)決定分辨能力。如果我們把單個(gè)的孔做到足夠小，只容許孔內(nèi)有一個(gè)氨基酸分子，那么它的信息就有可能被精確識(shí)別。”馮建東介紹，團(tuán)隊(duì)嘗試人工創(chuàng)造一個(gè)具有單個(gè)氨基酸敏感性區(qū)域、幾乎是目前世界上最小的人工納米孔，這樣納米孔測(cè)量的“盲盒”內(nèi)就可以?xún)H存1個(gè)氨基酸。
“類(lèi)似于不同體型的人過(guò)一扇窄門(mén)，有的人可以順利通過(guò)，有的人則會(huì)被擋在門(mén)外?！瘪T建東說(shuō)，科研人員通過(guò)電壓在一張三層原子厚度的二硫化鉬上“戳”出一個(gè)洞，其實(shí)是讓它丟掉一些原子，開(kāi)出一扇僅容許一個(gè)氨基酸通過(guò)的“門(mén)”。這扇“門(mén)”的直徑在亞納米到1.6納米之間。
“不同氨基酸的體積不同，且表面帶一定的電荷，當(dāng)它們通過(guò)納米孔時(shí)，通過(guò)納米孔的離子電流會(huì)受到微小的擾動(dòng)。當(dāng)不同的氨基酸經(jīng)過(guò)這扇‘門(mén)’時(shí)，受到的擾動(dòng)程度就會(huì)不一樣?！眻F(tuán)隊(duì)成員、浙江大學(xué)化學(xué)系博士生王馥實(shí)介紹，研究人員通過(guò)區(qū)分?jǐn)_動(dòng)程度來(lái)識(shí)別不同的氨基酸。
蛋白質(zhì)單分子測(cè)序再進(jìn)一步
研究人員通過(guò)對(duì)納米孔的極限結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)，將當(dāng)前納米孔測(cè)量分辨率推進(jìn)到0.94道爾頓，實(shí)現(xiàn)了直接分辨單個(gè)氨基酸分子的目標(biāo)，并且可在同一納米孔內(nèi)區(qū)分16種不同類(lèi)型的天然氨基酸，解決了納米孔蛋白測(cè)序空間分辨率的核心難題。
馮建東認(rèn)為，使用納米孔高精度識(shí)別單個(gè)氨基酸的策略，為納米孔單分子蛋白質(zhì)測(cè)序提供了物理解析的可行性基礎(chǔ)。
自然界的蛋白質(zhì)分子有著難以想象的復(fù)雜性，除了序列，不同的化學(xué)修飾的變化也會(huì)產(chǎn)生豐富的“變異”，而這些“變異”與人類(lèi)疾病息息相關(guān)。比如，蛋白質(zhì)的異常糖基化修飾會(huì)導(dǎo)致多種重大疾病，如白血病、阿爾茨海默病等。
蛋白質(zhì)的磷酸化修飾在細(xì)胞周期、生長(zhǎng)、凋亡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。在這項(xiàng)工作中，研究人員實(shí)現(xiàn)了用納米孔來(lái)識(shí)別氨基酸的磷酸化。這一結(jié)果表明納米孔未來(lái)有望應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)，助力疾病診斷和預(yù)防。
“目前，我們的方法可以用于分辨不同的單個(gè)氨基酸分子；將來(lái)，希望能夠一次性識(shí)別更復(fù)雜組合的多肽鏈，以及復(fù)雜的化學(xué)修飾。”馮建東表示，蛋白質(zhì)測(cè)序是目前納米孔領(lǐng)域最受關(guān)注的應(yīng)用之一，單個(gè)氨基酸分子的識(shí)別是一個(gè)好的開(kāi)端，后續(xù)如何完成對(duì)從氨基酸到肽鏈，再到復(fù)雜折疊的蛋白質(zhì)的識(shí)別仍是更大的挑戰(zhàn)和機(jī)遇。
（原標(biāo)題：可直接分辨單個(gè)氨基酸分子 小小納米孔破解蛋白質(zhì)測(cè)序難題）
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